Contrôle de qualité

Deux échantillons d'ADN du panel du Centre d'Etude du Polymorphisme Humain (CEPH), dont le génotype pour les marqueurs étudiés est connu, sont

Table 2.3: Mélange réactionnel pour une amplification individuelle du marqueur par PCR sur une plaque de 96 puits

Région	Marqueurs	Hétérozygotie
Séquenceurs utilisés	ABI 373/377	MégaBACE
Produits	Quantité	Quantité
ADN	30 ng	20 ng
dNTPs	0.2 $mM$	0.06 $mM$
MgCl2	2.5 $mM$	2.5 $mM$
Tampon	1X	1X
Triton	0.1%	0
5cmPrimers Forward et Reverse	0.67$\mu M$	0.67$\mu M$
5cmAmpliTaq Gold (ADN polymérase)	0.5U	0.4U
Volume final (qsp H20)	15 $\mu l$	10 $\mu l$
Suite du tableau à la page suivante $\Rightarrow$

1- pour les séquenceurs ABI 373/377, lancé sur le thermocycleur Techne genius

Table 2.4: Différentes étapes du cycle de la PCR le plus souvent utilisé

Température	Temps	Répétition (cycles)
92c	10 min. (dénaturation initiale)
91c	40 sec. (dénaturation)
69c	30 sec (hybridation et extension)
90c	40 sec.
64c	30 sec.
89c	40 sec.
59c	30 sec.
89c	40 sec.
55c	30 sec.
72c	5 min (élongation finale)
15c	15 min.

2- pour le séquenceur MégaBACE, lancé sur le thermocycleur 9700PCR system Perkin Elmer

Température	Temps	Répétition (cycles)
95c	12 min. (dénaturation initiale)
94c	15 sec. (dénaturation)
55c	15 sec (annealing)
72c	30 sec (extension)
89c	15 sec.
5 5c	15 sec.
72c	30 sec.
72c	10 min (élongation finale)
15c	15 min.

Figure 2.1: Principe de la PCR
(d'après [Swynghedauw, 2001])

Figure 2.2: Représentation de différents profils génétiques de différents individus analysés par le programme Genetic Profiler
Chaque graphe correspond à un individu et chaque pic "bleu" correspond à un allèle du marqueur analysé. Par exemple, le premier individu a un allèle de taille 103 pb et un autre allèle de taille de 109 pb.

inclus dans chaque gel analysé comme témoins internes de la qualité de la manipulation. Après l'analyse des profils alléliques, l'homogénéisation des données obtenues entre les différents gels et la vérification des relations intrafamiliales est réalisée à l'aide du logiciel Marksyn (Alibert O., Généthon). Une analyse globale des différentes erreurs de génotypes ou d'erreurs de concordance dans les familles, mais également d'erreurs de transmission mendélienne, est effectuée par le programme PedCheck [O'Connell and Weeks, 1998].