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Le génotypage des microsatellites a été réalisé par l'utilisation de séquenceurs automatiques pour le premier criblage, ABI PRISM 373 (36 puits) et 377 (96 puits) (PE Applied Biosystems) et pour le deuxième criblage, MegaBACE 1000. Les différents profils alléliques du marqueur sont visualisés grâce au marquage des microsatellites lors de l'amplification par PCR (réaction de polymérisation en chaîne) via l'utilisation d'une amorce marquée par un fluorochrome à son extrémité 5'. Sur un même individu, plusieurs microsatellites de tailles proches peuvent être analysés dans un même gel ou un même capillaire via l'utilisation de différents fluorophores : TET (tétrachlorofluorescéine, fluorescent dans le vert), FAM (5-carboxyfluorescéine, fluorescent dans le bleu) et HEX (6-carboxy 2',4',7',4,7 -hexachlorofluorescéine, fluorescent dans le jaune). Les groupes de microsatellites ("le pool des microsatellites") à analyser ensemble sont établis en fonction de la taille des marqueurs et de leur couleur. Ainsi, environ 8 marqueurs dont 3 de tailles voisines avec des fluorochromes différents peuvent être étudiés ensemble. Le protocole de la PCR le plus largement utilisé est rapidement décrit dans les tableaux 2.3Mélange réactionnel pour une amplification individuelle du marqueur par PCR sur une plaque de 96 puits et 2.4Différentes étapes du cycle de la PCR le plus souvent utilisé. La PCR est une succession de cycles d'amplification comportant une étape de dénaturation de la double hélice de l'ADN, une étape d'hybridation des amorces sur l'ADN cible et une étape de synthèse du fragment analysé (c'est-à-dire l'élongation des amorces en prenant pour modèle le brin hybridé à l'amorce) (Figure 2.1Principe de la PCR).
Pour pouvoir déposer plusieurs marqueurs sur un seul puits, différents protocoles sont appliqués selon le séquenceur utilisé. Dans le cas des séquenceurs ABI PRISM 373 et 377, le programme "PrepManip" est utilisé pour déterminer la quantité de produits de PCR nécessaire pour le poolage, ainsi que le volume à déposer sur le gel. Les ADN amplifiés sont dénaturés dans un mélange de 2 composé de formamide déionisée, d'un marqueur de taille (TAMRA) et d'un tampon de charge (bleu de dextran) par chauffage pendant 5 min à 96c et refroidissement brutal dans la glace. Les échantillons sont déposés dans les puits du gel des séquenceurs 373/377 et soumis à une électrophorèse sur gel d'acrylamide avec une durée de migration d'environ 3 heures.
Dans le cas du séquenceur MegaBACE 1000, 2 pour les marqueurs FAM et TET et 3 pour HEX sont mélangés dans le même puits, suivi de leurs dilutions avec 15 d'eau. Puis, 20 du mélange est purifié à l'aide d'une colonne contenant du Sephadex G-50 Superfine (Amersham Pharmacia Biotech AB), tassé par une centrifugation de 3 minutes à 1500g. Le produit purifié est récupéré lors d'une centrifugation de 2 minutes à 1100g et 2 de ce produit est dénaturé dans un mélange de charge (ET-ROX400) contenant comme marqueur de taille ROX. Ils sont analysés par le séquenceur MegaBACE 1000. La durée de migration de l'électrophorèse est d'environ 2 heures.
Un marqueur de taille, couplé à un fluorochrome (TAMRA ou ROX) est présent dans chaque puits et migre en même temps que l'ADN. Cela permet de calibrer et de définir la taille des différents allèles du microsatellite dans l'intervalle d'environ 50-500pb. Pour les séquenceurs ABI 373/377, l'analyse des données brutes, ainsi que le calcul de la taille des fragments (en fonction du marqueur de taille), correspondant au nombre de répétitions (CA), se font à l'aide du logiciel GeneScan analysis (PE Applied Biosystems). L'analyse des profils alléliques pour chaque marqueur pour les différents individus est réalisée à l'aide du logiciel Genotyper (PE Applied Biosystems). Pour le séquenceur MégaBACE, l'analyse globale se fait à l'aide du programme Genetic Profiler (GE Healthcare) (Figure 2.2Représentation de différents profils génétiques de différents individus analysés par le programme Genetic Profile).
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anouar
2009-08-22