Le gène CYLD (CYLinDromatosis tumor suppressor)

Comme décrit précédemment, de nombreuses études ont identifié un locus de prédisposition au psoriasis, désigné PSORS8, sur le chromosome 16q [Nair et al., 1997,Allen et al., 2003,Karason et al., 2003,Sagoo et al., 2004]. En plus du gène candidat CARD15, cette région comporte un autre gène d'intérêt, CYLD, qui régule également la voie NF-$k$B. Le gène CYLD, qui est exprimé de façon ubiquitaire, code pour une protéine suppresseur de tumeur cytoplasmique de fonction encore peu connue. Des analyses sur le plan protéique ont révélé un domaine central contenant des motifs spécifiques des protéines associées aux microtubules ainsi qu'un domaine catalytique, au niveau de la région C-terminale, caractéristique des enzymes de déubiquitination. L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle réversible de protéines cibles par une chaîne enzymatique, aboutissant à la liaison covalente d'une ou de plusieurs protéines "d'ubiquitine" sur une lysine acceptrice de la protéine cible. La poly-ubiquitination entraîne essentiellement la dégradation de la protéine cible par un complexe enzymatique. Cependant, elle peut également moduler les activités, le trafic ou la localisation de certaines protéines cibles.
Des mutations, principalement au niveau du domaine catalytique du gène CYLD, ont été associées avec des maladies génétiques de la peau comme la forme familiale de trichoépithéliome multiple, la cylindromatose familiale et le syndrome de Brooke-Spiegler, caractérisées par la survenue de multiples tumeurs cutanées bénignes (au niveau du visage, du cuir chevelu ou des glandes sudoripares). Ces maladies résultent de mutations à type de "perte de fonction" du gène CYLD qui aboutissent à une activation inappropriée de voies de signalisation (NF-$k$B et JNK). Ceci pourrait déclencher la transformation néoplasique (division cellulaire incontrôlée) en partie par une résistance élevée à l'apoptose [Bignell et al., 2000,Reiley et al., 2004,Stegmeier et al., 2007]. Même si les mécanismes moléculaires restent encore peu identifiés, de nombreuses études semblent indiquer que CYLD régulerait négativement deux voies de signalisation impliquées dans les réponses inflammatoires et immunitaires et la croissance cellulaire, celle de NF-$k$B et de JNK (c-Jun N-terminal kinase) (la voie d'un autre facteur de transcription AP-1). Dépendant de l'activation de différents récepteurs de l'immunité tels que TNFRs (Tumor Necrosis Factor receptors), Toll-like récepteurs (TLR) ou TCR par différents stimuli, l'enzyme CYLD à activité de déubiquitinylase interagit avec des protéines activatrices de ces voies de signalisation et leur enlève les chaînes d'ubiquitines présentes au niveau des lysines (lysine 63 ou 48 selon la protéine), nécessaires à leur activité. Par exemple, la régulation négative de l'activation de la voie NF-$k$B par CYLD semble dépendre de l'interaction de CYLD avec un composant du complexe IKK, NEMO (NF-$k$B essential modulator). Elle dépendrait aussi de la déubiquitination (lysine 63) par CYLD de deux autres protéines associées à des récepteurs immuns TRAF (TNF receptor-associated factor), TRAF2 et TRAF6 [Trompouki et al., 2003]. Ceci pourrait entraîner l'inhibition du complexe IKK (IkB kinase) et par conséquent, de NF-$k$B, favorisant ainsi l'apoptose. Il est intéressant de noter que l'action inhibitrice de CYLD sur les deux voies de signalisation IKK et JNK semble être dépendante des stimuli. CYLD est, par exemple, un régulateur négatif de la voie JNK lors d'une stimulation des différents récepteurs immuns (TNFR, TLR 4 ou IL1-R) par les stimuli TNF$\alpha$, LPS et IL1$\beta$, contrairement à son action sur la voie IKK. CYLD intervient sur cette dernière lors de stimulations par LPS et IL1$\beta$ et non par TNF$\alpha$, en agissant sur une protéine commune aux récepteurs stimulés, telle que TRAF6. L'ubiquitination de TRAF2 semble d'ailleurs essentielle dans l'activation de la voie JNK stimulée par

Figure 3.7: Structure DL du gène CYLD (voir annexe annexefig2)

Table 3.15: Identification et analyse d'association des TagSNPs de CYLD sur le Lot I par FBAT

									FBAT Lot I
	1	rs8056611			4381846	A$>$G	48.3$^{1}$	H	49.3	106	1.490	0.14
		2	rs718226			4383762	A$>$G	43.3$^{1}$	H	39.4	103	1.476
		3	rs3785142	Intron 5		4401346	C$>$T	49.2$^{1}$	H	50.7	100	0.967
		4	rs12324931	Intron 6		4404357	A$>$C	9.6$^{1}$	H
		5	rs1420871	Intron 11		4429631	G$>$A	6.7$^{1}$	H	10.6	44	0.213
		6	rs4027241	Intron 13		4433765	G$>$A	49.2$^{1}$	H	51	101	0.944
		7	rs4785226	Intron 15		4437163	C$>$A	49.1$^{1}$	H	44.5	96	-1.109
		8	rs2066852	Exon 18	D804D	4441717	C$>$T	6.7$^{1}$	H	9.7	46	0.035
		9	rs2302759	Intron 18		4441800	C$>$T	14.2$^{1}$	H	13.5	56	-0.708
		10	rs1861762			4453847	G$>$A	48.3$^{1}$	H	51	100	-1.871
		11	rs9635531			4455994	C$>$T	38.8$^{1}$	H
		12	rs4785452			4456276	C$>$T	47.5$^{1}$	H	50.4	104	-2.123
		13	rs4785453			4456361	C$>$T	49.1$^{1}$	H
		14	rs13332720			4457160	A$>$G	46.4$^{1}$	H	40.6	93	1.115
		15	rs6500335			4457555	G$>$C	7.3$^{1}$	H	8.8	38	-0.134
		16	rs16948851			4457608	A$>$G	6.9$^{1}$	H	8.9	42	-0.249
		17	rs7205760			4458972	G$>$C	9.2$^{1}$	H	13.1	54	0.456
		18	rs12925755			4460361	C$>$A	33.6$^{1}$	H	33	109	1.037
$^{b}$ NM_015247 ; $^{c}$ NT_010498.15

TNF$\alpha$, plus que dans la voie IKK [Reiley et al., 2004]. Néanmoins, l'implication de CYLD dans la régulation de ces deux différentes voies de signalisation dans les cellules T serait apparemment due à son rôle dans le contrôle de l'activité d'une protéine intervenant en amont de ces deux voies, la Tak1 (transforming growth factor-B-activated kinase1). CYLD interagit physiquement avec cette kinase et inhibe ainsi son ubiquitination [Reiley et al., 2007]. CYLD a donc un rôle important dans la régulation négative de l'activation des cellules T via l'activation de Tak1 et des kinases en aval (JNK et IKK) dans les cellules T. Ce rôle pivot de CYLD a d'ailleurs été constaté lors de l'étude d'un modèle murin Cyld-/-. Les souris Cyld-/- développent spontanément des anomalies de l'inflammation du colon, similaires aux symptômes de la maladie humaine inflammatoire de la voie gastro-intestinale, la maladie de Crohn. Ces symptômes d'auto-immunité et d'inflammation du colon sont dus à l'hypersensibilité des cellules T Cyld-/- à la stimulation du TCR [Reiley et al., 2007]. Paradoxalement, cette protéine semble aussi intervenir dans l'étape de maturation du développement des cellules précurseurs des cellules T (les thymocytes) en régulant cette fois-ci positivement le signal de la voie de signalisation TCR. Pour cela, CYLD interagirait avec une protéine kinase initiatrice du signal TCR, Lck sous forme active, en lui enlevant les chaines poly-ubiquitines des lysines 48 et 63 et en favorisant l'association avec la protéine Zap-70. Cette activation est nécessaire pour enclencher les cascades de cette voie de signalisation [Reiley et al., 2006]. De plus, CYLD aurait également une fonction dans le cycle cellulaire, indépendante de son rôle dans la régulation de la voie NF-$k$B. Il serait requis pour l'entrée en mitose et pour la cytokinèse (division du cytoplasme) en régulant la poly-ubiquitination de certains régulateurs de la division cellulaire [Stegmeier et al., 2007].

En raison des différentes activités de CYLD décrites ci-dessus, nous avons voulu tester par une étude d'association l'implication du gène CYLD dans le psoriasis chez 45 familles. Les données sur les SNPs sélectionnés selon l'état du déséquilibre de liaison présent au niveau du locus (Figure 3.7Structure DL du gène CYLD) ainsi que les résultats obtenus après leur analyse par FBAT sont exposés dans le tableau 3.15Identification et analyse d'association des TagSNPs de CYLD sur le Lot I par FBAT. Cette analyse montre une faible association entre le psoriasis et deux SNPs, rs1861762 et rs4785452 avec une valeur de P de 0.06 et 0.03 respectivement. Lors de l'analyse haplotypique de toutes les combinaisons de paires de SNPs du gène CYLD, de faibles associations entre la maladie et deux haplotypes ont également été obtenues (0.01<P<0.04) (Tableau 3.16Analyse d'association des haplotypes de CYLD sur le Lot I par FBAT). Cependant, cette analyse ne révèle pas de nouvelles associations car les deux haplotypes protecteurs associés sont constitués d'au moins un des SNPs associés dans l'analyse par SNP (rs4785452). Nous avons tenté néanmoins de répliquer ces résultats. Aucune association n'a été observée entre la maladie et les deux SNPs lors de leur analyse par la méthode "LNMs" (Tableau 3.17Analyse d'association des TagSNPs de CYLD dans le Lot I avec la méthode "LNMs"). En revanche, malgré l'absence d'association dans le lot II, leur

Table 3.16: Analyse d'association des haplotypes de CYLD sur le Lot I par FBAT

		Lot I
				MAF	Z	P
1/12	AT	45.9	-2.004	0.045	0.041	(0.11)
	GC	48.9	2.532	0.011	0.011	2(0.019)
		AT	48.1	-2.274	0.023	0.023

Table 3.17: Analyse d'association des TagSNPs de CYLD dans le Lot I avec la méthode "LNMs"

			Lot I
						P
rs1861762	G>A	51	0.19	1.14 [0.94-1.38]	1.29 [1.07-1.57]
rs4785452	C>T	50.4	0.33	1.10 [0.91-1.34]	1.21 [0.99-1.48]

Table 3.18: Analyse d'association des TagSNPs de CYLD, suggestifs dans le Lot I, faite sur un deuxième lot de 83 familles (Lot II) et sur l'ensemble des lots (Lot I et Lot II)

	Lot I				Lot II				Lot I + Lot II
		MAF	N	Z	P	MAF	N	Z	P	MAF	N	Z
rs1861762	51	100	-1.87	0.06	49.2	70	-0.251	0.80	50.1	170	-1.638	0.10
rs4785452	50.4	104	-2.12	0.03	46	54	-0.897	0.37	48.1	158	-2.239	0.03

Table 3.19: Analyse d'association des TagSNPs de CYLD dans les sous groupes porteurs ou non de l'allèle à risque HLA-Cw6 dans le Lot I

		Lot I
						Stratifié selon:
						présence HLA-Cw6			absence HLA-Cw6
				MAF	P	N	Z	P	N
rs8056611	A>G	49.3	0.14	68	2.839	0.005	53	-1.040	0.30
rs718226	A>G	39.4	0.14	64	2.420	0.01	49	-0.622	0.53
rs3785142	C>T	50.7	0.33	63	1.913	0.05	49	-0.722	0.47
rs1420871	G>A	10.6	0.83	32	-0.179	0.86	20	0.633	0.53
rs4027241	G>A	51	0.35	64	1.148	0.25	51	0.058	0.95
rs4785226	C>A	44.5	0.27	62	-2.015	0.05	45	0.747	0.46
rs2066852	C>T	9.7	0.97	32	-0.180	0.86	22	0.305	0.76
rs2302759	C>T	13.5	0.48	39	-1.211	0.23	23	0.619	0.54
rs1861762	G>A	51	0.06	68	-1.881	0.06	49	-0.534	0.60
rs4785452	C>T	50.4	0.03	68	-2.772	0.006	52	0.098	0.92
rs13332720	A>G	40.6	0.27	57	1.926	0.05	45	-0.550	0.58
rs6500335	G>C	8.8	0.89	26	-0.009	0.99	19	-0.200	0.84
rs16948851	A>G	8.9	0.80	29	-0.144	0.89	19	-0.213	0.83
rs7205760	G>C	13.1	0.65	35	0.904	0.37	27	-0.344	0.73
rs12925755	C>A	33	0.33	64	1.695	0.09	59	-0.407	0.68

analyse dans l'ensemble des 126 familles confirme l'association du rs4785452 avec le psoriasis (P=0.03) (Tableau 3.18Analyse d'association des TagSNPs de CYLD, suggestifs dans le Lot I, faite sur un deuxième lot de 83 familles (Lot II) et sur l'ensemble des lots (Lot I et Lot II)).
De plus, l'association de ce gène au psoriasis est aussi dépendante de l'allèle majeur à risque, HLA-Cw6. Plusieurs associations sont observées entre le psoriasis et certains des SNPs de CYLD lorsque seuls les porteurs de l'allèle HLA-Cw6 sont analysés (P<0.04). Les meilleures associations sont obtenues pour les SNPs rs8056611 et rs4785452 (P=0.005, P=0.006 respectivement)(Tableau 3.19Analyse d'association des TagSNPs de CYLD dans les sous groupes porteurs ou non de l'allèle à risque HLA-Cw6 dans le Lot I).
L'ensemble de ces résultats indique donc une association entre ce gène et le psoriasis dépendant de HLA-Cw6. Une étude récente de la structure de DL du locus indique que les SNPs associés ne sont pas en fort déséquilibre de liaison (r$^2$<0.40) avec ceux associés de CARD15, indiquant ainsi une nouvelle association. Le seul SNP qui reste associé dans la totalité des familles est rs4785452 à environ 10kb en aval de CYLD proche de la région 3' du gène LOC727992 codant une protéine de fonction inconnue. Ce variant n'est pas en déséquilibre de liaison avec le variant rs2066852, le seul polymorphisme codant de CYLD connus dans la population caucasienne. L'association observée pourrait être due à d'autres variants non encore identifiés, dans la région promotrice ou dans le gène. Cependant, en raison de la proximité de ces deux gènes, il se pourrait que l'association observée pour ces gènes soit due à un SNP dans la région encore inconnue en déséquilibre de liaison avec l'ensemble des SNPs associés de CYLD et CARD15. Une étude plus approfondie de ce gène serait nécessaire afin de vérifier le rôle fonctionnel hypothétique du SNP rs4785452 ou d'identifier le vrai SNP causal.