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Technique

Cette technique a été réalisée sur des plaques de 384 puits. En raison des imprécisions lors de la manipulation de petits volumes, le robot TAP (The Automation Partnership) a été utilisé pour répartir, de manière organisée, l'ADN des individus (1 $\mu l$ à 10ng/$\mu l$) dans 3 plaques de 384 puits ainsi que pour distribuer le mélange réactionnel. Une plaque "test" regroupe également une douzaine d'individus pris au hasard par plaque de 384 puits, des "doublons", servant de contrôle de qualité du génotypage. Chaque plaque contient de plus une moyenne de 4 témoins négatifs (sans ADN).
Pour chaque SNP, les amorces et les sondes ont été désignés ("Assays-by-Design") et fournis par le service ABI (Applied Biosystems). La réaction est réalisée dans un volume final de 5 $\mu l$ à partir de 10 ng d'ADN, 2.5 $\mu l$ de "master mix taqman UNG" (2X), 0.075 $\mu l$ de "Assay mix" (40X). Les conditions pour les réactions d'amplification par PCR sur les thermocycleurs Dual 96-Well GeneAmp PCR system 9700 sont les suivantes : 92c 10 min, puis 92c 15 s, 60 ou 54c (varie selon la qualité du génotypage) 1 min répétée durant 50 cycles (varie selon la qualité du génotypage final) et 15c infini. Les conditions restent spécifiques du SNP étudié et sont choisies en fonction des meilleures conditions obtenues après des tests sur 32 individus du panel du CEPH.
La collecte des signaux de fluorescence suivie du traitement des résultats, obtenus sur ABI PRISM 7900 HT, est réalisée par le logiciel SDS Sequence Detector Software (SDSv2.0, Applied Biosystems, Foster City, California, United States). Ce programme permet, à partir des proportions calculées de la fluorescence émise par chaque rapporteur (FAM et VIC) spécifique d'un allèle du marqueur étudié, de représenter les génotypes de l'ensemble des individus sous forme de 3 nuages de points représentant tous les génotypes possibles pour un SNP biallélique: les individus homozygotes pour l'allèle X (X/X) (émission d'un seul fluorophore), les individus hétérozygotes pour l'allèle X et Y (X/Y) (émission des deux fluorophores) et les individus homozygotes pour l'allèle Y (Y/Y), Figure 2.7Représentation graphique des résultats du génotypage d'un SNP bi-allélique obtenu par Taqman.


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anouar 2009-08-22